Тестирование на мутации
Классификатор экспрессии генов мРНК
Классификатор микроРНК
Тест
ThyroSeq v2
ThyGenX
Панель мутаций при раке щитовидной железы
Afirma
Тирамир (предлагается в качестве рефлекторного теста, если тест на щитовидную железу отрицательный)
RosettaGX Раскрывает
Компания
UPMC, через CBLPath
Межпространственная диагностика
Задание
Veracyte
Межпространственная диагностика
Rosetta Genomics
Методология
Секвенирование следующего поколения
Секвенирование следующего поколения
ПЦР в реальном времени, пиросеквенирование
Матрица экспрессии мРНК
qRT-ПЦР
qRT-ПЦР
Количество протестированных мишеней
Горячие мутации в 14 генах и 42 типах слияний генов, включающих гены RET, PPARG, NTRK1, NTRK3, BRAF, THADA и ALK
Горячие мутации в пяти генах и слияния RET / PTC1, RET / PTC3, PAX8 / PPARG
Горячие мутации в четырех генах и слияния RET / PTC1, RET / PTC3, PAX8 / PPARG
142 мРНК
Десять микроРНК
24 микроРНК
Требования к образцам
1-2 капли из первой ФНО попадают в пробирку для сбора
Один специальный проход FNA в пробирку для сбора
Промывание иглы фиксатором на спиртовой основе (например, цитолитом), двумя неокрашенными предметными стеклами ткани или четырьмя неокрашенными предметными стеклами FNA
Два специальных канала для сбора FNA проходят через пробирку
Один специальный проход FNA в пробирку для сбора
Один окрашенный мазок FNA
Тестирование генной мутации / перегруппировки
Тестирование генной мутации и перегруппировки основано на десятилетиях изучения молекулярных изменений, ответственных за опухолеобразование щитовидной железы . Эти исследования завершились недавними крупномасштабными проектами секвенирования, такими как исследование секвенирования Cancer Genome Atlas (TCGA) , и привели к составлению всеобъемлющего профиля изменений при опухолях щитовидной железы.
В исследовании TCGA папиллярного рака щитовидной железы были изучены однонуклеотидные варианты, небольшие индели, изменения числа копий, перестройки, экспрессия мРНК, экспрессия микроРНК и метилирование ДНК 496 папиллярных карцином щитовидной железы [13]. Этот анализ выявил изменения драйверов в 96,5% случаев [13]. Таким образом, в настоящее время описаны мутации драйверов, которые являются причиной почти всех папиллярных форм рака щитовидной железы. Большинство изменений, наблюдаемых при папиллярном раке щитовидной железы, связаны с митоген-активируемой протеинкиназой (MAPK) и фосфатидилинозитол-3-киназой (PI3K). Знания, полученные в ходе предыдущих исследований и крупномасштабных проектов секвенирования, послужили основой для разработки панелей мутаций / перегруппировок генов.
Панели мутаций / перегруппировок семи генов
Панель из семи генов, включающая мутации и перестройки, наиболее часто наблюдаемые при раке щитовидной железы (составляющие примерно 70% случаев рака щитовидной железы), является одним из подходов к мутационному тестированию. Эти панели обычно включают горячие мутации в BRAF, NRAS, HRAS и KRAS, а также тестирование на слияние генов RET/PTC1, RET/PTC3 и PAX8/PPARG.
BRAF представляет собой серинтреонинкиназу, которая играет неотъемлемую роль в пути MAPK и важна для деления и дифференцировки клеток. Мутации в BRAF наблюдаются примерно в 40-45% папиллярных карцином щитовидной железы [14, 15]. Наиболее часто встречающейся мутацией BRAF является активирующая мутация V600E. Сообщалось о других мутациях, таких как K601E или небольших вставках или делециях в кадре [16—19]. Кроме того, активация передачи сигналов BRAF может происходить путем слияния BRAF с такими партнерами, как AKAP9, SND1 или MKRN1 [13, 20].
NRAS , HRAS и KRAS являются онкогенами, которые часто мутируют в нескольких опухолях. Активирующие мутации обычно происходят в кодоне 61 (наиболее часто), а также в кодонах 12 и 13. Мутации в NRAS, HRAS или KRAS были зарегистрированы в 40-50% фолликулярных карцином и 20-40% фолликулярных аденом [21–24]. О мутациях NRAS, HRAS или KRAS также сообщалось при неинвазивном фолликулярном новообразовании щитовидной железы с папилляроподобными ядерными особенностями (NIFTP) и инвазивном фолликулярном варианте папиллярной карциномы щитовидной железы [25—27].
Слияния, рассмотренные на панелях мутаций / перегруппировок семи генов, представляют собой слияния RET/PTC1 (слияние RET с CCDC6), RET/PTC3 (слияние RET с NCOA4) и PAX8/PPARG. Слияния RET / PTC1 и RET / PTC3 наблюдаются при папиллярном раке щитовидной железы. Частота которых составляет примерно 10% случаев (по сравнению с 20-30% два десятилетия назад [28–30]. Слияния PAX8/PPARG наблюдаются в основном при фолликулярных карциномах (30-40% случаев) [31–33]. Это слияние PAX8/PPARG также может наблюдаться, хотя и с меньшей частотой, при фолликулярных аденомах и фолликулярном варианте папиллярного рака щитовидной железы [31–35].
Все гены и перестройки в панели мутаций/перестроек из семи генов демонстрируют высокую специфичность и положительную прогностическую ценность (PPV) для рака (хотя PPV для NRAS, HRAS и KRAS ниже) [12, 36, 37]. Панель мутаций / перестроек из семи генов (или аналогичная панель из восьми генов, которая также включает перестройки TRK, которые встречаются в 5% случаев папиллярного рака щитовидной железы) была первоначально подтверждена в трех проспективных исследованиях в двух учреждениях, и было обнаружено, что она обладает высокой специфичностью 97-100% и высоким PPV 86-100% [12, 36, 37]. В последующих исследованиях аналогичных панелей из семи генов, включая ретроспективное исследование в одном учреждении и два проспективных многоинституциональных исследования теста Asuragen miRInform (в настоящее время коммерчески предлагаемого Interplace Diagnostics как тест ThyGenX), аналогичная высокая специфичность в 86-92% и PPV в 71-80% были обнаружены при FN / SFN узлах щитовидной железы [38—40]. Панели с семью генными мутациями / перегруппировками коммерчески доступны у таких поставщиков, как Quest Diagnostics или Interplace Diagnostics (ThyGenX). Тест ThyGenX был изменен по сравнению с тестом miRInform, чтобы также включать мутации в PIK3CA. ИзмененияPIK3CA были в основном описаны при малодифференцированном и анапластическом раке щитовидной железы [41–43].
Панель мутаций / перегруппировок ThyroSeq v2
Панель ThyroSeq v2 представляет собой масштабный тест на основе секвенирования следующего поколения (NGS). Использование технологии NGS позволяет проводить одновременный анализ нескольких генов экономически эффективным способом с высокой производительностью. Этот тест включает семь генов из других групп мутаций / перестроек (BRAF, NRAS, HRAS, KRAS, RET / PTC1, RET / PTC3, PAX8/PPARG), а также дополнительные гены, которые были вовлечены в рак щитовидной железы: AKT1, PTEN, TP53, TSHR, GNAS, CTNNB1, RET, PIK3CA, EIF1AX и TERT и перегруппировки RET, BRAF, NTRK1, NTRK3, PPARG и THADA [44].
EIF1AX — это новый ген, недавно описанный с рецидивирующей мутацией в исследовании TCGA папиллярной карциномы щитовидной железы [13]. EIF1AX является фактором, инициирующим трансляцию, и был обнаружен в 2% папиллярных карцином щитовидной железы; однако в последующем исследовании мутации в EIF1AX были также идентифицированы в двух фолликулярных аденомах и одном гиперпластическом узле, что позволяет предположить, что наличие мутаций в EIF1AX не является специфичным для карциномы [45]. МутацииEIF1AX также наблюдались в 11% малодифференцированных и 9% анапластических карцином щитовидной железы [46, 47]. Интересно, что в отличие от папиллярной карциномы щитовидной железы, где мутации EIF1AX обычно были взаимоисключающими с другими мутациями-драйверами, при малодифференцированном и анапластическом раке щитовидной железы наблюдалась тенденция к совместному возникновению мутаций EIF1AX и RAS [13, 46, 47]. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы полностью прояснить роль EIF1AX при раке щитовидной железы и выяснить, может ли быть совместный эффект между EIF1AX и RAS при малодифференцированном и анапластическом раке щитовидной железы.
Мутации промотораTERT являются еще одним важным изменением, присутствующим на панели ThyroSeq v2. Промоторные мутацииTERT, расположенные на 124 или 146 п.н. выше по течению от стартового кодона, были описаны как повторяющиеся изменения при фолликулярно–клеточном раке щитовидной железы; они не были обнаружены при медуллярном раке щитовидной железы или доброкачественных поражениях щитовидной железы [48—51]. Эти мутации, хотя и присутствуют в высокодифференцированных папиллярных карциномах щитовидной железы и фолликулярных карциномах, с повышенной частотой присутствуют в агрессивных опухолях, таких как низкодифференцированная карцинома, анапластическая карцинома щитовидной железы и широкоинвазивная онкоцитарная карцинома [48—51]. Кроме того, исследования выявили связь мутации промотора TERT с повышенным риском смертности от конкретного заболевания, отдаленных метастазов и персистирующего течения заболевания [51].
Панель ThyroSeq v2 также включает гены TP53, PIK3CA и AKT1. Эти гены связаны с агрессивным поведением и прогрессированием опухоли, и мутации в этих генах чаще наблюдаются при малодифференцированном и анапластическом раке щитовидной железы [41–43, 52–56]. Гены, которые предсказывают доброкачественное поведение, такие как активирующие мутации TSHR и GNAS, также включены в панель [57–61]. Примерно 50-80% гиперфункционирующих узлов содержат мутации TSHR, и примерно 3-6% гиперфункционирующих узлов содержат мутации GNAS [57–61]. О мутациях в TSHR или GNAS при фолликулярных карциномах сообщалось крайне редко [62].
Панель ThyroSeq v2 может дополнительно обнаруживать мутации в RET, которые наблюдаются при медуллярной карциноме щитовидной железы. Обе мутации, связанные со спорадической медуллярной карциномой щитовидной железы или синдромом MEN2B, такие как мутация в домене активирующей тирозинкиназы M918T или мутации во внеклеточном домене цистеина, связанные с синдромом MEN2A или семейной медуллярной карциномой щитовидной железы, могут быть обнаружены группой экспертов.
Наконец, панель ThyroSeq v2 может обнаруживать расширенный набор слитых генов. Перестройки, включающие NTRK1 и NTRK3, наблюдаются в 5% папиллярных карцином щитовидной железы [62–66]. В педиатрических случаях папиллярного рака щитовидной железы частота перестроек NTKR1 или NTRK3 может быть еще выше [67]. Слияния с участием THADA были зарегистрированы примерно в 1% папиллярных карцином щитовидной железы [13]. Слияния с участием гена ALK являются потенциально целенаправленными и наблюдались примерно в 1-2% папиллярных карцином щитовидной железы, 4-9% малодифференцированных карцином, 4% анапластических карцином щитовидной железы и 1-2% медуллярных карцином щитовидной железы [47, 68, 69].
ThyroSeq v2 был первоначально валидирован в рамках объединенного ретроспективного и проспективного исследования 143 FN /SFN цитологических узлов щитовидной железы в одном учреждении [44]. Результаты этого исследования показали в целом очень хорошие показатели со специфичностью 93%, чувствительностью 90%, PPV 83% и NPV 96% [44]. В последующем проспективном исследовании 465 узловых образований щитовидной железы AUS / FLUS, проведенном в одном учреждении, была отмечена аналогичная хорошая эффективность анализа с чувствительностью 90,9%, специфичностью 92,1%, PPV 76,9% и NPV 97,2% [ 70]…………….. [
Тестирование классификатора экспрессии
Классификатор экспрессии генов мРНК
Классификатор экспрессии генов Afirma (GEC) , предлагаемый Veracyte , был разработан путем изучения профилей экспрессии генов узлов щитовидной железы и использования этих данных для подготовки молекулярного классификатора [71]. Классификатор Afirma использует характер экспрессии 142 генов для отнесения узлов к одной из двух категорий: доброкачественные или подозрительные [8, 71]. Первоначальная валидация теста Afirma была проведена с использованием 265 неопределенных узлов в многоинституциональном исследовании [71]. Были отмечены как высокая чувствительность (90%), так и NPV (94%); более низкие значения были отмечены для специфичности (52%) и PPV (37%) [71]. Последующие исследования в других учреждениях с более высокой распространенностью заболевания показали более низкие NPV [72–75]. Во многих из этих исследований было трудно окончательно установить частоту истинно негативных или ложноотрицательных результатов, поскольку многие пациенты с доброкачественными результатами тестирования Afirma не подвергались хирургической резекции. Недавний метаанализ семи исследований показал объединенную чувствительность 95,7% и объединенную специфичность 30,5% [76].
В дополнение к Afirma GEC, Afirma предлагает два классификатора злокачественных новообразований, Afirma MTC и Afirma BRAF. Эти классификаторы злокачественных новообразований рекомендуются для выполнения при узлах щитовидной железы, которые имеют подозрительный результат Afirma GEC или являются SMC по цитологии. Классификатор Afirma MTC исследует экспрессию генов, дифференциально экспрессирующихся при медуллярной карциноме щитовидной железы. В недавнем небольшом валидационном исследовании классификатора MTC сообщалось о чувствительности 96,3% [77]. Классификатор Afirma BRAF анализирует экспрессию генов, дифференциально экспрессируемых в узлах щитовидной железы с мутацией BRAF V600E.
Классификатор экспрессии микроРНК
микроРНК (miRNAs) представляют собой небольшие некодирующие РНК, которые важны для регуляции экспрессии генов. Исследования продемонстрировали дифференциальную экспрессию нескольких микроРНК при раке щитовидной железы; некоторые дополнительно показали связь с прогностическими признаками, такими как прогрессирующее заболевание или экстратиреоидное расширение [78, 79].
Компания Rosetta Genomics предлагает анализ на микроРНК-классификаторе (Rosetta GX Reveal). В этом анализе исследуется экспрессия 24 микроРНК из одного окрашенного диагностического мазка, чтобы классифицировать узлы как “подозрительные на злокачественность по профилированию микроРНК”, “положительные на медуллярный маркер” или “доброкачественные” [80]. В многоцентровом ретроспективном исследовании, в котором использовалось в общей сложности 109 цитологических образцов Bethesda III и IV, сообщалось, что этот тест показал чувствительность 85%, специфичность 72% и NPV 91% [9].
В тесте ТирамИРА (межпространственная диагностика) также используется панель микроРНК для классификации узлов щитовидной железы как “положительных” или “отрицательных”. Тест ThyraMIR анализирует экспрессию десяти микроРНК и в настоящее время предлагается в качестве рефлекторного тестирования на узловые образования, которые являются отрицательными, с помощью панели мутаций / перегруппировок восьми генов ThyGenX . Эффективность этого анализа, как сообщалось в первоначальном валидационном исследовании, основанном на анализе в общей сложности 150 цитологических образцов Bethesda III и IV (которые не включали ни одного случая клеточного рака Хертле), составляет чувствительность 57%, специфичность 92%, NPV 82% и PPV 77% [40].
Сравнение результатов тестов
Чувствительность измеряет долю фактических положительных результатов, которые являются истинно положительными, а специфичность измеряет долю отрицательных результатов, которые являются истинно отрицательными. Чувствительность и специфичность отражают рабочие характеристики теста. PPV и NPV, однако, будут различаться в зависимости от распространенности заболевания. Например, популяция пациентов с более высокой частотой рака щитовидной железы, чем популяция, в которой тест был подтвержден, будет иметь более низкий NPV . Другим фактором, который может повлиять на наблюдаемый NPV и PPV, могут быть институциональные различия в частоте злокачественных новообразований для каждой неопределенной цитологической категории. Опубликованные характеристики эффективности теста приведены в таблице 15.2.
Таблица 15.2
Сравнение опубликованных характеристик эффективности молекулярных тестов щитовидной железы
| Тип исследования | Цитология (категория Bethesda) | Количество случаев | Чувствительность | Специфичность | NPV | PPV |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
ThyroSeq | Перспективный | III | 96 | 91% | 92% | 97% | 77% |
Ретроспективный и проспективный анализ | IV | 143 | 90% | 93% | 96% | 83% | |
Afirma | Перспективный | III | 129 | 90% | 53% | 95% | 38% |
IV | 81 | 90% | 49% | 94% | 37% | ||
RosettaGX Раскрывает | Ретроспектива | III, IV | 150 | 74% | 74% | 92% | 43% |
ThyGenX и Тирамир | Перспективный | III | 58 | 94% | 80% | 97% | 68% |
IV | 51 | 82% | 91% | 91% | 82% |
Сильными сторонами панелей мутаций / перегруппировок генов являются их высокая специфичность и PPV при злокачественных новообразованиях. В целом, эти тесты используются для “исключения” злокачественных новообразований. Сильными сторонами классификаторов экспрессии генов являются их высокая чувствительность и NPV. Этот тест используется для “исключения” злокачественности. Идеальный диагностический тест должен обладать высокой чувствительностью, специфичностью, NPV и PPV-активностью и быть способным как выявлять, так и исключать злокачественное новообразование. Комбинированное тестирование — это один из применяемых подходов: например, добавление теста ТирамИРА к тесту ThyGenX дает чувствительность 89%, специфичность 85%, NPV 94% и PPV 74%. Кроме того, добавление классификаторов злокачественных новообразований Afirma MTC или Afirma BRAF может добавить некоторую специфичность Afirma GEC , хотя никаких данных об этом пока опубликовано не было.
Из имеющихся в настоящее время в продаже тестов тест ThyroSeq v2 демонстрирует большие перспективы как самостоятельный тест, который может использоваться как для выявления, так и для исключения злокачественности, с NPV 96% и PPV 83% в узлах FN / SFN и NPV 97,2% и PPV 76,9% в узлах AUS / FLUS . Дальнейшее понимание патогенеза щитовидной железы и потенциальной роли взаимодействующих генов или мутаций может помочь в дальнейшем уточнении NPV и PPV группы. В частности, изменения RAS , которые могут наблюдаться при карциномах, а также при доброкачественных/ вялотекущих новообразованиях, таких как фолликулярные аденомы или NIFTP , снижают риск злокачественного развития на 74-87%, чем другие изменения, такие как мутация BRAF V600E, которая имеет риск злокачественного развития >95% [12, 36, 37]. Знание различий в риске, основанных на наличии конкретной генной мутации, может служить руководством к ведению пациентов. Кроме того, использование больших панелей мутаций на основе NGS позволило бы обнаружить сопутствующие мутации (например, в TP53 или EIF1AX), которые могут оказаться связанными с повышенным риском.
Использование результатов молекулярного профилирования в клиническом лечении
Характеристики эффективности теста легли в основу клинических алгоритмов использования молекулярного тестирования при принятии периоперационных решений [81]. Для получения положительного результата на панелях мутаций / перестроек семи генов, которые обладают высокой специфичностью и высоким PPV, неопределенные цитологические узлы щитовидной железы можно лечить с помощью онкологической тиреоидэктомии. Отрицательный результат на панели мутаций / перестроек семи генов может быть устранен с помощью наблюдательной или диагностической лобэктомии щитовидной железы при узлах AUS / FLUS и диагностической лобэктомии щитовидной железы при узлах FN / SFN или SMC. Классификаторы экспрессии генов обладают высокой чувствительностью и высоким NPV. Для получения благоприятного результата было бы уместно наблюдение или диагностическая лобэктомия щитовидной железы, а при подозрительном результате на узелки AUS / FLUS или FN / SFN следует рассмотреть, по крайней мере, диагностическую лобэктомию.
Для панели ThyroSeq v2 , которая обладает хорошей общей чувствительностью, специфичностью, NPV и PPV, можно рассмотреть следующий клинический алгоритм (рис. 15.1). Когда тест отрицателен на все изменения, в узлах с цитологией Bethesda III и IV (а вероятность рака до тестирования соответствует ожидаемой для этих категорий Bethesda) остаточная вероятность рака, как ожидается, составит 3-4%. Согласно рекомендациям NCCN, за этими пациентами может проводиться наблюдение, аналогичное рекомендациям для доброкачественных цитологических узлов. Для узлов с положительным результатом ThyroSeq тип мутации и другие результаты теста позволяют предсказать вероятность развития рака в узле и оценить, насколько агрессивен рак, помогая определить наиболее подходящий хирургический подход. Изолированная RAS или RAS-подобная мутация предсказывает высокую вероятность (~80%) либо рака низкого риска, либо предраковой опухоли, NIFTP . Многие из этих пациентов могут быть вылечены с помощью терапевтической лобэктомии, которая в настоящее время рекомендуется при раке щитовидной железы низкого риска. Изолированные BRAF V600E или другие BRAF V600E-подобные мутации обеспечивают очень высокую (>95%) вероятность развития рака с промежуточным риском рецидива заболевания. Риск может быть дополнительно изменен клиническими параметрами; например, небольшие (<1 см) опухоли могут по-прежнему представлять низкий риск. Таким пациентам может быть проведена тотальная тиреоидэктомия или лобэктомия. Положительный результат теста на множественные драйверные мутации фактически является диагностическим признаком рака и предсказывает значительный риск рецидива заболевания и смертности, связанной с опухолью. Этим пациентам была бы полезна тотальная тиреоидэктомия с учетом диссекции центрального компартментарного лимфатического узла.
Рисунок 15.1
Алгоритм клинического ведения с использованием теста ThyroSeq v2 , основанный на риске, обусловленном конкретными мутациями. При отрицательных узловых образованиях риск развития рака составляет 3-4%, аналогично таковому при доброкачественных цитологических узлах, и их можно лечить под наблюдением. Узловые образования, положительные по RAS-подобной мутации, имеют риск развития либо рака низкого риска, либо NIFTP , и их можно лечить с помощью лобэктомии. Узловые образования, положительные на BRAF-подобную мутацию, относятся к раку среднего риска и могут лечиться с помощью тотальной тиреоидэктомии или лобэктомии. Узловые образования, положительные на множественные драйверные мутации, относятся к раку высокого риска, и их можно лечить с помощью тотальной тиреоидэктомии с возможной местной лимфодиссекцией
Исследования показали, что использование молекулярного тестирования может помочь избежать ненужных операций и может сократить количество двухэтапных операций (начальная лобэктомия с последующей завершающей тиреоидэктомией). В исследовании 471 пациента с цитологическими узлами AUS / FLUS или FN / SFN , пациентам, у которых не было тестирования на мутацию / перестройку семи генов, в 2,5 раза чаще требовалась двухэтапная операция [82]. Исследования по моделированию экономической эффективности панелей мутаций / перегруппировок семи генов, тестирования классификатора экспрессии генов и комбинированного тестирования мутаций и микроРНК показывают потенциальную экономию средств [83, 84].
Выводы
Достижения в области технологий и дальнейшее выяснение молекулярных механизмов, лежащих в основе патогенеза опухоли щитовидной железы, сделали возможным включение молекулярного тестирования в ультразвуковое и цитопатологическое исследования при ведении пациента с узловыми образованиями щитовидной железы. Коммерчески доступно несколько тестов, и в каждом из них используются разные методологии для определения молекулярных изменений в неопределенных узлах щитовидной железы. У этих тестов есть свои сильные и слабые стороны; некоторые из них отлично подходят для определения злокачественности, а некоторые — для исключения злокачественности. Использование этих тестов все чаще внедряется в клиническую практику и потенциально может снизить затраты за счет сокращения количества ненужных операций. Вероятно, будут достигнуты дальнейшие успехи в тестировании и эффективности тестов, которые могут оказаться полезными, например, для прогнозирования агрессивности опухоли или ответа на терапию.