Рис. 29.1
Предметное стекло на жидкой основе, приготовленное на аппарате Thinprep и окрашенное пятном Папаниколау . Одно предметное стекло обеспечивает репрезентативный монослой аспирированного материала.
Некоторые жидкие образцы можно использовать для получения цитоспина. Этот метод концентрирует жидкую пробу, и часть помещается в цитофунку на цитоцентрифужной машине. Этот метод позволяет получить монослой клеток в пределах четко определенной области предметного стекла. В зависимости от объема образца можно сделать несколько предметных стекол для разных типов пятен, хотя пятно Папаниколау является наиболее распространенным. Этот метод чаще всего используется, когда клеточность образца невелика (рис. 29.2).
Рис. 29.2
Препарат Цитоспин, окрашенный пятном Папаниколау после сбора жидкого фиксирующего препарата. Этот метод часто применяется, когда взятый образец невелик.
Клеточные блоки изготавливаются из фиксированного в формалине образца для взятия проб. Клеточный блок может быть получен несколькими различными методами, в зависимости от методов, доступных конкретной лаборатории. Осадок, сгусток или фрагменты ткани обрабатываются и заливаются в парафин. Парафиновый блок разрезается на микротоме, который создает тонкие срезы ткани, которые затем помещаются на предметные стекла. Конечным продуктом являются традиционно окрашенные гематоксилином и эозином (H & E) предметные стекла. Лаборатория автора обычно не использует клеточные блоки. По нашему опыту, этот метод не дает дополнительной информации, за исключением случаев, когда метастатическая карцинома должна быть подтверждена иммуногистохимическими анализами (рис. 29.3).
Рис. 29.3
Репрезентативный образец клеточного блока, окрашенный гематоксилином и эозином. Эти образцы собираются в жидком фиксаторе и заливаются парафином для вырезания срезов для размещения на предметных стеклах.
Существует множество методов прямой подготовки предметных стекол. Для приготовления мазков аспират удаляют на предметное стекло так, чтобы кончик иглы скошенным вниз касался стекла, чтобы свести к минимуму разбрызгивание образца и возможное пересыхание на воздухе любых предметных стекол, зафиксированных спиртом.
29.3.1 Классическая техника взятия мазка
- 1.
Нанесите матовым концом два идентификатора пациента (имя, дату рождения, медицинскую карту и т.д.) карандашом № 2
- 2.
Поместите небольшую каплю аспирата в нескольких миллиметрах от матового конца
- 3.
Поместите еще одно предметное стекло на край капли под углом 45 ° и дайте капле образца растечься по краю второго предметного стекла
- 4.
Уменьшите угол, затем аккуратно и быстро равномерно отодвиньте образец от матового конца вниз по предметному стеклу, стараясь, чтобы мазок находился на расстоянии не менее 1 мм от краев стекла
- 5.
Немедленно зафиксируйте спиртом или аэрозолем одно предметное стекло для окрашивания по Папаниколау, которое будет выполнено в лаборатории. Другое предметное стекло можно высушить на воздухе и окрасить модифицированным препаратом Романовски для РОУЗ или в лаборатории (рис. 29.4а, б).
Рис. 29.4
(a) Правильно подготовленный прямой предметный препарат с классическими мазками. На левом предметном стекле представлен мазок, окрашенный по Романовскому, а на правом — мазок, окрашенный по Папаниколау, в котором содержится необходимое количество образца и края мазка остаются на расстоянии не менее 1 мм от краев предметного стекла. (b) Неправильно приготовленный прямой предметный препарат с классическими мазками. На левом предметном стекле представлен мазок, окрашенный по Романовскому, а на правом — мазок, окрашенный по Папаниколау. На обоих предметных стеклах слишком много образца, в результате чего образец занимает все предметное стекло. Давление при размазывании было неравномерным, что также привело к неоднородностям в мазке
В зависимости от количества отсасываемого материала может быть изготовлено несколько предметных стекол. Оптимально, чтобы за каждый проход получали одно высушенное на воздухе и одно фиксированное спиртом предметное стекло. При желании можно выполнить процедуру ROSE и оценить образец с использованием обоих красителей.
29.3.2 Техника взятия мазка с форзаца
- 1.
Карандашом № 2 нанесите на два слайда на матовом конце два идентификатора пациента (имя, дату рождения, медицинскую карту и т.д.).
- 2.
Поместите небольшую каплю аспирата в середину одного предметного стекла.
- 3.
Поместите маркированную матовую сторону второго предметного стекла лицевой стороной вниз на предметное стекло с каплей образца.
- 4.
Дайте образцу растечься под действием капилляров, не оказывайте давления.
- 5.
Когда образец перестанет растекаться, откройте предметные стекла, как книгу, или раскройте их. НЕ ПЕРЕКЛАДЫВАЙТЕ ИХ ДРУГ НА ДРУГА.
- 6.
В результате будут получены два зеркальных изображения срезов. Немедленно зафиксируйте спиртом или аэрозолем один предметный образец для окрашивания по Папаниколау, которое будет выполнено в лаборатории. Другое предметное стекло можно высушить на воздухе и окрасить модифицированным препаратом Романовски для РОУЗ или в лаборатории (рис. 29.5а, б).
Рис. 29.5
(a) Правильно подготовленное прямое предметное стекло методом форзацев. На левом слайде представлен мазок, окрашенный по Романовскому, а на правом — мазок, окрашенный по Папаниколау, который содержит необходимое количество образца и создает зеркальное отображение слайдов за один проход. (b) Неправильно подготовленный прямой предметный препарат с подставками для книг. На левом предметном стекле представлен мазок, окрашенный по Романовскому, а на правом — мазок, окрашенный по Папаниколау. На обоих предметных стеклах слишком много образца, в результате чего образец занимает все предметное стекло. Накладка плохо прилегает к образцу из-за увеличенной толщины образца. Проблему с толщиной можно было бы устранить, применив дополнительное предметное стекло для удаления излишков образца, что позволило бы получить дополнительные, более подготовленные предметные стекла.
Этот метод гарантирует, что в результате каждого прохода FNA получается одно предметное стекло для метода воздушной сушки и одно предметное стекло для метода спиртовой фиксации. При желании на предметном стекле с воздушной сушкой можно выполнить роузинг. Мазки из форзаца отображают слайды как зеркальное отражение друг друга, позволяя сопоставлять окрашенные по Папаниколау и Романовски слайды с каждого прохода. Эта уникальная функция дает возможность повторно оценить атипичные клетки, видимые на предметном стекле Романовского, на предметном стекле Папаниколау. Область атипии на предметном стекле Романовского должна быть сопоставлена с областью на зеркальном изображении предметного стекла Папаниколау, чтобы попытаться выявить атипию. Хотя этот метод приводит к некоторому увеличению трехмерных характеристик, в целом он оказывает минимальное влияние на цитологические характеристики, используемые для диагностики FNA щитовидной железы.
Ни для одного из методов взятия мазка большее количество образцов не дает большего количества диагностического материала или более качественных предметных стекол. Для непатолога это может показаться нелогичным, но для получения адекватных слайдов для оценки требуется лишь небольшое количество надлежащим образом полученного образца. Любой из методов подготовки может привести к получению слишком толстого образца, если на предметное стекло помещается слишком много. Исправить некачественно сделанный классический мазок сложнее, чем мазок с форзаца. Если мазок на форзаце слишком толстый, к исходному предметному стеклу можно прикоснуться дополнительным предметным стеклом с надписью, чтобы удалить излишки образца, и все предметные стекла можно окрасить по желанию (см. Таблицу 29.1).
Таблица 29.1
Сравнение различных методов подготовки и фиксации образцов
Различия в препаратах FNA щитовидной железы | ||
|---|---|---|
Подготовка и фиксация | ||
Жидкая основа | Классические мазки | Обложки для книг |
Сбор флаконов с жидкостью | Коллекция слайдов | Коллекция слайдов |
Только влажная фиксация | Влажная и / или сухая фиксация | Влажная и / или сухая фиксация |
Только окраска по Папаниколау | Окраска Папаниколау и / или Романовского | Окраска Папаниколау и / или Романовского |
Один слайд для оценки | несколько отдельных слайдов | Несколько слайдов (зеркальные изображения для Pap и Romanowsky) |
Стабильное качество слайдов | Качество зависит от практики | Качество в меньшей степени зависит от практики |
Равномерный монослой | Неравномерная, с большей площадью для скрининга | Неравномерная , с умеренной площадью для скрининга |
РОЗАa не подходит | Имеет право на участие РОЗА | Имеет право на участие РОЗА |
Диагностические особенности | ||
Снижение коллоидности | Коллоид виден на Романовском | Коллоид виден на Романовском |
Снижение фонового уровня крови | Немного анализа крови на влажном предметном стекле | Немного анализа крови на влажном предметном стекле |
Разбиваются большие фрагменты | Сохранены крупные сосочки | Сохранены крупные сосочки |
Количество внутриядерных включений уменьшено | Сохраняются внутриядерные включения | Сохраняются внутриядерные включения |
Потеря телец псаммомы | Видны тела псаммомы | Видны тела псаммомы |
ROSE a быстрая оценка на месте
29.4 Фиксация
Предпочтения цитопатологов в отношении методов фиксации различаются в зависимости от типа окраски’ которую они предпочитают использовать для интерпретации образца. Автор предпочитает использовать как смоченные спиртом фиксированные предметные стекла, так и высушенные на воздухе предметные стекла, потому что некоторые цитологические особенности легче распознать по одному пятну по сравнению с другим. Некоторые методы подготовки образца позволяют разделить одну аспирацию на два или более предметных стекла, при этом по крайней мере одно предметное стекло можно зафиксировать влажным, а другое — сухим.
После получения мазков или формочек для книг крайне важно быстро обработать предметные стекла, подлежащие влажной фиксации. Существует несколько методов влажной фиксации образца. Спрей-фиксатор для предметных стекол, на которые будет нанесено окрашивание по Папаниколау, выполняется быстро и легко, однако требует дополнительного времени на подготовку в лаборатории. Перед окрашиванием предметных стекол закрепляющий спрей необходимо смочить в 95%-ном этиловом спирте. Если этого не сделать, можно заметить низкое качество окрашивания. Спрей-фиксатор не вызывает лизиса крови на предметном стекле, что может нанести вред, если образец кровянистый. Предметное стекло следует удерживать на расстоянии 12 дюймов от пульверизатора, и спрей следует наносить без промедления, хорошо покрывая образец. Любая задержка приведет к появлению эффекта воздушной сушки при окрашивании по Папаниколау. Хорошо покрытые фолликулярные клетки будут хорошо сохранены и хорошо визуализированы, если мазок не будет слишком кровянистым и густым.
Фиксация в 95 %-ном этиловом спирте происходит быстро и легко. Поскольку предметное стекло помещается непосредственно в емкость с 95 %-ным спиртом, процесс происходит быстрее, а образец на предметном стекле получается более ровным по сравнению с капельками фиксирующего спрея. Предметные стекла не обязательно погружать в спирт, если они были пропитаны не менее чем на 15 минут [3]. Поскольку некоторые образцы FNA содержат кровь, тот факт, что алкоголь лизирует часть фоновой крови, может быть полезным. Размеры клеток аналогичны размерам образцов тканей; однако они меньше, чем увеличенные клетки на предметных стеклах, высушенных на воздухе.
Менее часто используемым влажным фиксатором является saccomannos . В его состав входит 2% карбовакса или полиэтиленгликоля в этиловом спирте. Этим методом можно фиксировать образцы клеточных блоков и предметные стекла.
Какой бы из используемых методов мокрой фиксации ни использовался, крайне важно, чтобы это происходило быстро. Когда клетки высыхают, они набухают и кажутся крупнее, а детали ядра теряются. Края хорошо закрепленных мазков могут даже пересыхать на воздухе, в результате чего эти клетки становятся непригодными для интерпретации.
Последним методом фиксации предметного стекла является воздушно-сухой метод. В то время как влажные фиксированные предметные стекла обеспечивают лучшую детализацию ядра, высушенные на воздухе предметные стекла обеспечивают лучшую визуализацию цитоплазмы и внеклеточных компонентов, таких как коллоид или амилоид. Предметные стекла с воздушной сушкой также позволяют проводить ROSE в клинике или у постели больного. После получения мазка или предметных стекол для формочек образец можно оставить до высыхания или обмахнуть веером. Очень важно, чтобы предметное стекло перед окрашиванием было полностью сухим.
29.5 Окрашивание
Влажные фиксированные образцы чаще всего окрашивают пятном Папаниколау . Пятно Папаниколау — это полихроматическое пятно с несколькими красителями, которые по-разному окрашивают различные части клетки [4]. Гематоксилиновый компонент окрашивает ядро в темно-синий цвет, а три кислых компонента красителя окрашивают цитоплазму, придавая ей более бледный цианофильный вид. Окрашивание по Папаниколау является жизненно важным компонентом диагностики FNA щитовидной железы, поскольку оно эффективно выявляет ядерные изменения папиллярного рака щитовидной железы, такие как бороздки и включения. Это также помогает в диагностике поражений клеток Хертле и С-клеток, поскольку ядерные изменения легче оценить.
Высушенные на воздухе предметные стекла окрашены одним из многих красителей Романовского. Два компонента красителя включают метиленовый синий и эозин Y [4]. Комбинация этих двух красителей окрашивает ядро и ядрышко в темно-фиолетовый цвет, а цитоплазму — в бледно-фиолетово-синий. Метахроматическая природа этого окрашивания позволяет получить красновато-фиолетовый спектр, который полезен при оценке некоторых секреторных гранул и внеклеточных компонентов, таких как коллоид и амилоид, которые окрашиваются не так хорошо, как окраска по Папаниколау. Это окрашивание простое и быстрое, что делает его предпочтительным для ROSE . См. Таблицу 29.2.
Таблица 29.2
Различия в окрашиваниях по Папаниколау и Романовски для аспирации щитовидной железы
Пятно Папаниколау | Пятно Романовского |
|---|---|
Подготовка к мокрой фиксации | Препарат, высушенный на воздухе |
Возможно получение биопсийного материала воздушно-сухим способом | Артефакты фиксации отсутствуют |
Уменьшение размера клеток | Увеличение размера клеток |
При фиксации возможна некоторая потеря клеточности | Отсутствие потери клеток при фиксации |
Четкие ядерные бороздки и включения | Плохие ядерные бороздки и включения |
Плохие интрацитоплазматические характеристики | Сохранены особенности цитоплазмы (гранулы) |
Характерные особенности плоскоклеточной цитоплазмы | Заметные особенности плоскоклеточной цитоплазмы |
Внеклеточный материал (коллоид ) плохо визуализируется | Внеклеточный материал легко визуализируется |
29.6 Вспомогательные исследования
В редких случаях требуется дополнительное тестирование для характеристики узелка. Для этого могут потребоваться различные методы сбора образцов в зависимости от вспомогательных тестов. Иммуногистохимические исследования могут проводиться в зависимости от клеточности образца. Из блока клеток могут быть вырезаны дополнительные срезы. Предметные стекла на жидкой основе и цитоспин иногда могут иметь дополнительно подготовленное предметное стекло. При использовании ранее окрашенных предметных стекол, предметное стекло должно быть удалено до проведения иммуногистохимического анализа.
Когда дифференциальный диагноз включает лимфоидные поражения, может быть полезна проточная цитометрия. Этот образец должен быть промыт несколькими проходами, сделанными в узелок, или специальными проходами, промытыми в специальной среде для проточной цитометрии, такой как RPMI (среда Мемориального института Розуэлл-Парка). Это может быть использовано для исследования узлов щитовидной железы, а также лимфатических узлов. Если образцы для проточной цитометрии отправляются в лабораторию на ночь, их следует отправлять холодными.
Если диагностика FNA щитовидной железы относится к одной из неопределенных категорий, могут быть использованы молекулярные тесты щитовидной железы в соответствии с Рекомендациями Американской ассоциации щитовидной железы [5]. Требования к сбору и / или доставке этих тестов различаются в зависимости от используемого теста, и читатель должен ознакомиться с инструкциями производителя.
Иногда берутся образцы, не относящиеся к щитовидной железе. Для оценки поражения паращитовидных желез следует подготовить срезы FNA обычным способом, а оставшуюся часть образца можно промыть в стерильную пробирку с красной крышкой, содержащую 1 куб. см физиологического раствора, для измерения уровня ПТГ. Это называется вымыванием ПТГ. Эта же процедура используется для оценки лимфатических узлов шеи с подозрением на метастатическое поражение папиллярной карциномой щитовидной железы. После подготовки предметных стекол для цитологического исследования оставшуюся часть образца промывают в 1 куб. см физиологического раствора для анализа на тиреоглобулин.